中國全面抗戰爆發後，陳納德主要負責中國空軍培訓建設，同時也參與組織指揮中國空軍對日作戰。1938年2月至5月，陳納德以中國空軍顧問身份深度參與了武漢空戰。據稱他指揮中國空軍與蘇聯援華航空志願隊密切配合，在武漢多次空戰中取得擊落日機46架的輝煌戰績。蘇聯援華航空志願隊是1937年10月下旬應蔣介石請求來華參戰的。在蔣介石請求蘇聯派航空志願隊來華的同時，宋美齡在蔣介石授意下希望陳納德到歐美國家秘密招聘空勤人員，組建一支國際志願航空隊來華。1937年10月，陳納德僱用一些法國、美國、荷蘭和德國人，組成一個「國際中隊」，卻僅參與了兩次行動便在湖北孝感機場遭日軍空襲摧毀。但這段經歷為陳納德後來組建飛虎隊積累了經驗。
飛虎隊飛機頭部的鯊魚嘴。 作者供圖
1940年，中國抗日戰爭進入到相持階段。蔣介石於當年5日20日召見陳納德，要求他前往美國，同常駐美國的蔣介石特使宋子文一起爭取美國的軍事援助，特別是飛機和飛行員。陳納德返抵華盛頓後經過不懈的努力，通過羅斯福助手獲得美高層關注。1941年4月15日，羅斯福簽署法令，允許美軍退役或預備役人員以「私人身份」赴華作戰。羅斯福還同時批准對華首批空軍援助：100架P-40B戰鬥機、100名飛行員、190名地勤人員。陳納德成功撬動了美國對華軍事支持，促成了飛虎隊組建。
獲得羅斯福秘密開放綠燈後，陳納德開始以「中央飛機製造公司」名義在美國招募赴華參戰空勤人員。中央飛機製造廠由國民政府與美國多家航空企業於1933年12月合資設立。初始地點在今杭州筧橋。1938年遷到雲南瑞麗的雷允（靠近滇緬公路），並曾在緬甸仰光、八莫設立分廠，組裝戰機。陳納德招募的對象主要來自美國陸軍航空隊、海軍及海軍陸戰隊。因美國尚未對日宣戰，所有應招的美軍人員需先退役或休長假，以民間身份赴華。應招人員以個人身份與中央飛機製造廠訂立為期一年的合同。應招待遇：飛行員月薪600至750美元（遠高於美軍現役），每擊落一架日機獎勵500美元；地勤月薪300至400美元。包船票、保險及帶薪休假。由於報酬有吸引力，陳納德很快招募到110名飛行員，以及約150至200名地勤人員。1941年7月10日，第一批美國志願航空隊員由美國舊金山啟程前往中國，他們的護照上，顯示着音樂家、學生、銀行家和農民等五花八門的身份。
1941年8月1日，蔣介石發布訓令，宣布成立「中國空軍美國志願大隊」，也稱「美國志願航空隊」（英文縮寫AVG），陳納德任上校指揮官，總部在昆明巫家壩機場。在志願大隊的美國飛行員中，40名來自陸軍航空隊、60名來自海軍及海軍陸戰隊，多數為後備役軍官，也有少數是在美國政府授意下從現役航空隊自願退役的飛行員。志願大隊裝備的100架P-40B型戰鬥機，全部通過美國《租借法案》提供給中國，再轉交這支隊伍使用。
美國志願大隊成立後，陳納德立即開始對志願隊成員進行專門訓練。一開始的培訓基地在緬甸的同古（今稱東吁），因為昆明巫家壩機場當時處於雨季，而且巫家壩機場處於日本轟炸機作戰半徑內，安全性低。同古機場雖設施簡陋、環境惡劣（叢林環繞、蟲蛇肆虐），但具備基本跑道條件。英國提供同古機場給飛虎隊訓練的目的是希望飛虎隊在日軍進攻緬甸時能協助其防禦。在同古受訓期間，飛虎隊員生活環境極其艱苦，宿舍沒有廁所、熱水，蟲蛇肆虐，隊員需自備蚊帳，伙食很差，瘧疾、登革熱頻發，部分人員因無法忍受而辭職。
1941年11月，陳納德將整訓後的美國航空志願大隊編為3個驅逐中隊：第1中隊為「亞當夏娃」隊，飛機上畫着亞當拿着蘋果追求夏娃的圖案；第2中隊為「熊貓」隊，飛機上畫的是熊貓和飛行員的漫畫像；第3中隊為「地獄天使」隊，飛機上畫的是紅色的天使。根據中英協議，「地獄天使」中隊協助英國皇家空軍保衛仰光，而「亞當夏娃」隊和「熊貓」隊則於11月18日秘密飛往昆明建立基地。駐仰光的飛虎隊「地獄天使」中隊後來深度參與了緬甸戰場的防禦與滇緬公路的保衛，他們攻擊日軍車隊、機場，為英美盟軍和中國遠征軍提供空中支援，特別是在保衛仰光的空戰中表現出色，得到英王的獎勵。
1941年12月20日上午，駐守昆明總部巫家壩機場的飛虎隊第1中隊（「亞當夏娃」隊）和第2中隊（「熊貓」隊），迎來了對日作戰的首次實戰，也是飛虎隊在第二次世界大戰中的首次空戰。在當天的空戰中，擊落10架來犯日機中的9架，自身無一受損，取得9:0的驕人戰績。美國志願航空隊昆明首戰大捷，是太平洋戰爭爆發後盟軍在亞洲戰場的首次空戰勝利，極大鼓舞了中國軍民士氣，也提振了反法西斯盟國人民的抗戰決心與信心。中國各界對此反應熱烈。全國媒體廣泛傳播，成為抗戰精神的重要象徵。
昆明市民目睹空戰勝利，奔走相告，群情振奮，沿街鳴放鞭炮，有人甚至從城處將日軍飛機殘骸抬進城裏示眾。昆明地方政府與民眾於當晚舉行慶功大會，為參戰飛行員披紅戴花。昆明民眾還紛紛到志願隊所在的空軍基地慰問，並見到了志願隊飛機頭部噴塗的呲牙裂嘴的「大鯊魚」。因為從沒見過鯊魚，就把鯊魚頭圖像說成了「飛老虎」。「飛虎隊」的稱呼便在民間流傳開來。後來昆明及雲南報紙報章在報道中都將志願隊稱為「飛虎隊」。「飛虎隊」的威名便迅速傳遍全國乃至全世界。「飛虎」這個名稱越傳越廣，越叫越響，連陳納德也覺得「飛虎」這個稱呼很好，將航空隊正式命名為「飛虎隊」（Flying Tigers）。
