中国全面抗战爆发后，陈纳德主要负责中国空军培训建设，同时也参与组织指挥中国空军对日作战。1938年2月至5月，陈纳德以中国空军顾问身份深度参与了武汉空战。据称他指挥中国空军与苏联援华航空志愿队密切配合，在武汉多次空战中取得击落日机46架的辉煌战绩。苏联援华航空志愿队是1937年10月下旬应蒋介石请求来华参战的。在蒋介石请求苏联派航空志愿队来华的同时，宋美龄在蒋介石授意下希望陈纳德到欧美国家秘密招聘空勤人员，组建一支国际志愿航空队来华。1937年10月，陈纳德雇用一些法国、美国、荷兰和德国人，组成一个“国际中队”，却仅参与了两次行动便在湖北孝感机场遭日军空袭摧毁。但这段经历为陈纳德后来组建飞虎队积累了经验。

1940年，中国抗日战争进入到相持阶段。蒋介石于当年5日20日召见陈纳德，要求他前往美国，同常驻美国的蒋介石特使宋子文一起争取美国的军事援助，特别是飞机和飞行员。陈纳德返抵华盛顿后经过不懈的努力，通过罗斯福助手获得美高层关注。1941年4月15日，罗斯福签署法令，允许美军退役或预备役人员以“私人身份”赴华作战。罗斯福还同时批准对华首批空军援助：100架P-40B战斗机、100名飞行员、190名地勤人员。陈纳德成功撬动了美国对华军事支持，促成了飞虎队组建。

获得罗斯福秘密开放绿灯后，陈纳德开始以“中央飞机制造公司”名义在美国招募赴华参战空勤人员。中央飞机制造厂由国民政府与美国多家航空企业于1933年12月合资设立。初始地点在今杭州笕桥。1938年迁到云南瑞丽的雷允（靠近滇缅公路），并曾在缅甸仰光、八莫设立分厂，组装战机。陈纳德招募的对象主要来自美国陆军航空队、海军及海军陆战队。因美国尚未对日宣战，所有应招的美军人员需先退役或休长假，以民间身份赴华。应招人员以个人身份与中央飞机制造厂订立为期一年的合同。应招待遇：飞行员月薪600至750美元（远高于美军现役），每击落一架日机奖励500美元；地勤月薪300至400美元。包船票、保险及带薪休假。由于报酬有吸引力，陈纳德很快招募到110名飞行员，以及约150至200名地勤人员。1941年7月10日，第一批美国志愿航空队员由美国旧金山启程前往中国，他们的护照上，显示着音乐家、学生、银行家和农民等五花八门的身份。

1941年8月1日，蒋介石发布训令，宣布成立“中国空军美国志愿大队”，也称“美国志愿航空队”（英文缩写AVG），陈纳德任上校指挥官，总部在昆明巫家坝机场。在志愿大队的美国飞行员中，40名来自陆军航空队、60名来自海军及海军陆战队，多数为后备役军官，也有少数是在美国政府授意下从现役航空队自愿退役的飞行员。志愿大队装备的100架P-40B型战斗机，全部通过美国《租借法案》提供给中国，再转交这支队伍使用。

美国志愿大队成立后，陈纳德立即开始对志愿队成员进行专门训练。一开始的培训基地在缅甸的同古（今称东吁），因为昆明巫家坝机场当时处于雨季，而且巫家坝机场处于日本轰炸机作战半径内，安全性低。同古机场虽设施简陋、环境恶劣（丛林环绕、虫蛇肆虐），但具备基本跑道条件。英国提供同古机场给飞虎队训练的目的是希望飞虎队在日军进攻缅甸时能协助其防御。在同古受训期间，飞虎队员生活环境极其艰苦，宿舍没有厕所、热水，虫蛇肆虐，队员需自备蚊帐，伙食很差，疟疾、登革热频发，部分人员因无法忍受而辞职。

1941年11月，陈纳德将整训后的美国航空志愿大队编为3个驱逐中队：第1中队为“亚当夏娃”队，飞机上画着亚当拿着苹果追求夏娃的图案；第2中队为“熊猫”队，飞机上画的是熊猫和飞行员的漫画像；第3中队为“地狱天使”队，飞机上画的是红色的天使。根据中英协议，“地狱天使”中队协助英国皇家空军保卫仰光，而“亚当夏娃”队和“熊猫”队则于11月18日秘密飞往昆明建立基地。驻仰光的飞虎队“地狱天使”中队后来深度参与了缅甸战场的防御与滇缅公路的保卫，他们攻击日军车队、机场，为英美盟军和中国远征军提供空中支援，特别是在保卫仰光的空战中表现出色，得到英王的奖励。

1941年12月20日上午，驻守昆明总部巫家坝机场的飞虎队第1中队（“亚当夏娃”队）和第2中队（“熊猫”队），迎来了对日作战的首次实战，也是飞虎队在第二次世界大战中的首次空战。在当天的空战中，击落10架来犯日机中的9架，自身无一受损，取得9:0的骄人战绩。美国志愿航空队昆明首战大捷，是太平洋战争爆发后盟军在亚洲战场的首次空战胜利，极大鼓舞了中国军民士气，也提振了反法西斯盟国人民的抗战决心与信心。中国各界对此反应热烈。全国媒体广泛传播，成为抗战精神的重要象征。

昆明市民目睹空战胜利，奔走相告，群情振奋，沿街鸣放鞭炮，有人甚至从城处将日军飞机残骸抬进城里示众。昆明地方政府与民众于当晚举行庆功大会，为参战飞行员披红戴花。昆明民众还纷纷到志愿队所在的空军基地慰问，并见到了志愿队飞机头部喷涂的呲牙裂嘴的“大鲨鱼”。因为从没见过鲨鱼，就把鲨鱼头图像说成了“飞老虎”。“飞虎队”的称呼便在民间流传开来。后来昆明及云南报纸报章在报道中都将志愿队称为“飞虎队”。“飞虎队”的威名便迅速传遍全国乃至全世界。“飞虎”这个名称越传越广，越叫越响，连陈纳德也觉得“飞虎”这个称呼很好，将航空队正式命名为“飞虎队”（Flying Tigers）。